外泌体中的miRNA，助纣为虐
肿瘤微环境对细胞生长，转移和分化至关重要。其中，外泌体通过其携带的RNA，蛋白因子等，担起了细胞间交流的工具。在这个过程中，外泌体对肿瘤的发生发展及治疗的耐药性又有着什么样的角色呢？今天，小编和大家分享一篇发表在《nature communications》上的研究，来认识下基质细胞通过外泌体的形式，将miRNA传送至卵巢癌细胞，进而影响了肿瘤细胞耐药的生物学过程。
Ovarian cancer（卵巢癌）是一种女性常见的恶性肿瘤，患者在术后化疗后，1-2年很容易复发或者由于化疗抗药而死亡。肿瘤微环境对于肿瘤细胞的生长，转移和分化至关重要。研究发现，外泌体中的蛋白，RNA等信号分子在肿瘤细胞的信号传递和转移中扮演着重要的角色。在该研究中，研究人员通过二代测序手段，鉴定到了由肿瘤相关纤维细胞（CAFs）和脂肪细胞（CAAs）来源的外泌体中的miRNA分子miR21，外泌体将其传送给卵巢癌细胞，进而影响了肿瘤细胞抗紫杉醇治疗的生物学现象。
为了鉴定由网膜基质细胞分泌外泌体传送到卵巢癌细胞的miRNA分子。研究人员对CAFs，CAAs和Ovarian cancer细胞，正常卵巢纤维细胞，脂肪细胞分离的外泌体进行了全基因组miRNA（isomiRs）测序，然后比较每1000个细胞中的miRNA表达情况。
结果显示，miR21及其家族miRNAs在外泌体中大量富集，且在所有的细胞类型中都能检测到。其中，正常卵巢纤维细胞，CAFs细胞，正常脂肪细胞和CAAs来源外泌体中miR21丰度大于肿瘤细胞，CAAs外泌体中丰度最高。qRT-PCR验证实验显示，成熟miR21，5’super变异体和前体变异体在细胞基质细胞中的表达明显比肿瘤细胞中高。
外泌体中的高表达miR21是否与细胞内源的miR21表达有关联呢？研究人员对正常脂肪细胞（NAs）,CAAs，正常纤维细胞（NFs）,CAFs和Ovarian cancer细胞进行qRT-PCR检测，发现也是在CAAs和CAFs中表达高。为进一步确认肿瘤组织基质细胞和表皮细胞中miR21的差异，研究人员在微切正常脂肪组织，CAAs，正常卵巢纤维组织，CAFs和卵巢癌细胞进行检测，也是在CAAs中表达最高。此外，通过in situ组织杂交实验也发现在正常脂肪细胞和纤维细胞中miR21表达比较低，在肿瘤细胞基质-表皮交界处和侵袭前端表达水平比较高。这些结果暗示着，miR21是通过临近的基质细胞分泌传递或者直接有临近细胞传递而来。值得注意的是，复发的肿瘤基质细胞和纤维细胞比原发肿瘤的细胞更高。体外细胞检测也显示，在抗化疗细胞系HeyA8 MDR和SKOV3TR比对照敏感细胞系中更高。在复发肿瘤细胞PEA2中比原发肿瘤细胞PEA1中高。这表明肿瘤微环境下的基质细胞可以通过直接传递或者通过载体传送。
为了验证上诉假设，研究人员将SKOC3ip细胞和带有FAM标签miR21的CAFs和CAAs细胞共培养，共聚焦观察荧光表达。结果显示，在共培养的肿瘤细胞中观察到了miR21的表达。那么，miR21是否是通过外泌体传递的呢？研究人员在CAFs和CAAs细胞中收集带FAM标签和pre-miR negative的外泌体，加入到SKOC3ip细胞中，结果在带FAM标签的孵育组中观察到荧光。表明miR21是从CAAs或者CAFs细胞中由外泌体传送至肿瘤细胞的。 由于CAA来源的外泌体中miR21含量多，那么，受体细胞中的miR21是否主要是由它传送而来？研究人员用从CAAs或者CAFs细胞中分离的相同数量的外泌体与SKOC3ip细胞共培养，qRT-PCR检测SKOC3ip细胞中miR21的含量，也确实证明由CAAs来源外泌体处理的细胞中含量更高。因此，肿瘤细胞中的miR21含量由外泌体决定。 为了进一步在体内验证该结果，研究人员将SKOC3ip细胞移植到裸鼠培养，成功后在基质纤维细胞中注射入FAM标签的miR21。24h后观察肿瘤组织荧光表达。结果显示，miR21在基质细胞外围和肿瘤细胞中都有表达。因此，miR21确实在体内有基质纤维细胞传送至肿瘤细胞的。
既然miR21通过外泌体由基质细胞传送到了肿瘤细胞中，那么，对肿瘤细胞产生什么样的影响呢？研究人员在SKOV3和OVCA432细胞中瞬时转染miR21前体和对照。观察细胞数目，结果发现没有异常情况。同样，通过体内移植实验也发现miR21对肿瘤细胞的增殖没有显著性的影响。因此，miR21对肿瘤细胞的增殖没有影响。
那么，miR21对肿瘤的运动性或者侵袭能力有影响么？对ALST，SKOV3和OVCA432细胞转染miR21前体，种植进transwell板，观察细胞侵袭能力。结果显示，三个细胞系的转染后侵袭潜能增强。体外划伤实验也进一步表明细胞的运动性能增加。因此，miR21增强了Ovarian cancer细胞的运动能力。
miR21对肿瘤细胞是否还有其他影响？研究人员对用含有miR21+/miR+MEFs（miR21-MEF）和miR21-/miR-MEFs(MEF)的外泌体处理OVCA432和SKOV3细胞，然后处理20 nM紫杉醇。结果显示，miR21+/miR+MEFs处理肿瘤细胞的数目明显多。将miR21前体直接转染到OVCA432和SKOV3细胞中，处理紫杉醇。结果表明，细胞对药物的敏感性降低，细胞凋亡减弱。此外，将miR的其他两个变异体（5’super variant和precursor variant）及成熟体转染肿瘤细胞，紫杉醇处理，结果也是一致的。
接下来是体内实验，裸鼠转染miR21-MEF和MEF注射的SKOV3ip细胞，7.5nM紫杉醇治疗。结果也显示，miR21-MEF组的肿瘤细胞对药物抗性更强。因此，miR21影响肿瘤细胞对紫杉醇的耐药性。
接下来的问题是回答miR21在肿瘤中的耐药作用机制是什么？研究人员对转染pre-miR21和对照的SKOV3细胞进行全转录组基因表达筛选。差异基因进行pathway分析，富集到抗化疗相关基因。其中，APAF1是一个已知跟抗化疗和凋亡相关基因。进一步的qRT-PCR验证也显示，在用CAAs和CAFs分离外泌体孵育的SKOV3细胞中的APAF1 mRNA表达显著降低。免疫组化数据也验证了APAF1的表达在基质-表皮连接处降低。
为验证APAF1是否为miR21的下游靶基因。研究人员在OVCA432和SKOV3转染miR21前体的细胞进行qRT-PCR检测，发现APAF1表达显著降低。用miR21的其他两个变异体处理也得到相同的结果，Western blot分析也表明APAF1蛋白表达水平也降低。针对38个肿瘤微切割组织样本中miR21和APAF1的表达相关性分析也表明，两者之间是负相关的。此外，肿瘤复发细胞系PEA2中APAF1的表达显著低于原发PEA1细胞。
为表明APAF1是否为miR21直接靶基因，对他们进行了序列比对，发现APAF1的coding序列区有潜在的miR21结合位点。进一步的荧光素酶系统检测也显示pre-miR21可以和APAF1结合而不是APAF1突变序列。因此，APAF1是miR21的直接靶基因。
研究人员在SKOV3和OVCA432细胞中转染全长APAF1序列，紫杉醇处理。结果显示，转染细胞系IC50显著下降，表明APAF1提高了肿瘤细胞对紫杉醇治疗的敏感度。那么，这个过程是否与miR21相关？研究人员在SKOV3和OVCA432细胞中转染pre-miR21和APAF1和只有pre-miR21。结果显示，AFAP1可以部分抵消掉对紫杉醇的耐药性。因此，miR21在影响抗药性时，miR21可能处理调控AFAP1外，还通过其他的机制影响紫杉醇耐药。进一步的裸鼠转染实验也表明，APAF1过表达组肿瘤组织对药物更加敏感。因此，APAF1影响了卵巢癌对于紫杉醇治疗的敏感性。
该研究通过外泌体中miRNA筛选，外泌体传送过程验证，在受体细胞中的作用机制及功能探究，为我们是展示了基质细胞如何通过向肿瘤细胞传送miR21，进而调控下游靶基因APAF1，影响肿瘤细胞紫杉醇化疗敏感性的生物学现象，为我们理解外泌体在卵巢癌中的作用机制及开发针对外泌体相关药物而治疗肿瘤化疗治疗耐药提供了依据。